生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶混合溅出物而设置的。
生物安全柜若使用不当会引起很多危害，因此，在使用该设备之前需要理清生物安全柜正确的使用方法。在操作前应将本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免双臂频繁穿过气幕破坏气流，并且在移入前要用75%酒精擦拭表面消毒，以去除污染。
打开风机5~10分钟后，待柜内空气净化并在气流稳定后再进行实验操作，将双臂缓缓伸入安全柜内，至少静止1分钟，使柜内气流稳定后再进行操作。提醒，生物安全柜内不放与实验无关的物品。
柜内物品摆放应做到清洁区、半污染区与污染区基本分开，操作过程中物品取用方便，且三区之间无交叉。另外，物品应尽量靠后放置，但不得挡住气道口，以免干扰气流正常流动。
在操作时，应按照从清洁区到污染区进行，以避免交叉污染。而为了防止可能溅出的液滴，可以在台面上铺上用消毒剂浸泡过的毛巾或纱布，但不能覆盖住安全柜格栅。设备使用期间，严禁使用酒精灯等明火，以避免产生的热量产生气流，干扰柜内气流的稳定。
工作时也要尽量减少背后人员走动以及快速开关房门，以防止安全柜内气流不稳定。此外，在实验操作时，不可打开玻璃视窗，应保证操作者脸部在工作窗口至上。在柜内操作时动作应该轻柔、舒缓，防止影响柜内气流。当设备使用完毕后，可关闭玻璃窗，保持风机继续运转10~15分钟，同时打开紫外灯，照射30分钟。
另外，生物安全柜还要定期进行检测与保养，以保证其正常工作。除了定期检测与保养外，还要定期进行清洁消毒。“生物安全柜内台面污染物可以在工作完成且紫外灯消毒后用2%的84消毒液进行擦拭，柜体外表面则应每天用1%的84消毒液擦拭。"
对于操作者而言，当进行高危险性操作时，例如生物安全水平2+到3级操作时，应选用长、背面开口的隔离衣和两副手套，并确保外层手套套住隔离衣口，且不能有暴露在外的肌肤。
与此同时，操作者也要遵循清洁区到污染区的操作原则。一般而言，生物安全柜的工作区应该被依次划分为三个区域：清洁区、工作区和污染区。
生物危害性废弃物袋应放置在污染区内;实验仪器和样品应放置在工作区域内;而实验供给品应放置在洁净区内。在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行。
需要注意的是，生物安全柜应尽量远离外部气流干扰因素，例如门窗、空调通风口、人员国道以及其他实验室气流干扰设备(安全柜、通风橱等)。操作者也要确保安全柜在工作时前窗处于正确的额定操作高度，切勿阻塞工作区前后的通风格栅，尽量在工作区的中心部位进行操作。
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